高效液相色譜法測定有機化合物的含量實驗

高效液相色譜儀液體作為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的主色譜分離技術，在基本理論方面與氣相色譜沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質差別。與氣相色譜相比，高效液相色譜對樣品的適用性強，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，可以彌補氣相色譜法的不足。

液相色譜根據固定向的性質可分為吸附色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜和大小排阻色譜。其中反相鍵合相色譜應用最廣，鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中固定液的液體通過化學反應鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。若采用極性鍵合相、非極性流動相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相，極性流動相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。

反相鍵合相色譜采用醇-水或腈-水體系作為流動相，純水廉價易得，紫外吸收小，在純水中添加各種物質可改變流動相選擇性。使用最廣泛的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即讓十八烷基（C18H37―）鍵合到硅膠表面，這也就是我們通常所說的碳十八柱。

高效液相色譜儀

1、儀器使用前的準備工作

（1）樣品與流動相的處理

配好的溶液需要用 0.45 μm 的一次性過濾膜過濾。純有機相或含一定比便例有機相的就要用有機系的濾膜，水相或緩沖鹽的就要用水系濾膜。

水、甲醇等過濾后即可使用；水放置一天以上需重新過濾或換新鮮的水。含穩定劑的流動相需經過特殊處理，或使用色譜純的流動相。

（2）更換泵頭里清洗瓶中的清洗液

流動相不同，清洗液也不同，如果流動相為甲醇-水體系，可以用 50%的甲醇；如果流動相含有電解質，通常用 95%去離子水甚至高純水。

如果儀器經常使用建議每周更換兩次，如果儀器很少使用則每次使用前必須更換。

（3）更換托盤里洗針瓶中的洗液

洗液一般為：50%的甲醇。
2、排除泵內氣泡

開關排氣閥時泵一定要關掉。具體操作如下：

（1）在泵關閉的情況下，打開排氣閥。

（2）選擇要排氣泡的通道，打開泵。

（3）按下泵前面板右下方的“Purge”鍵，儀器將以 6.0 mL/min 的速度自動快速清洗泵內殘留的氣泡，5 分鐘將自動停止。若想想手動停止，則再按再按“Purge”鍵，將停止清洗。

（4）換其他通道，排氣泡。

注意：使用快速清洗閥時，只能一個一個通道的排氣泡，不得將幾個通道同時按比例排氣泡，比例閥的快速切換易導致損壞。

（5）流路中沒有氣泡后，將泵關掉，再關排氣閥。

注意：排氣閥不能擰的過緊，也不能擰的過松，擰得過松流動相容易從清洗閥部位流進泵頭中引起報警。

3、設置柱溫箱的溫度

按住柱溫箱上的“+”或“-”鍵，直到數字開始閃爍時設定溫度。

4、系統的準備

（1）分析樣品前先用甲醇或乙腈沖洗流路約 20 分鐘，平衡活化色譜柱，并趕走管路中的雜質和水分。

（2）若流動相為有機相與水相的混合物，則第 1 步完成后，按照分析樣品的需要調節例閥的比例后沖洗流路約 20 分鐘后，待基線走平后即可進樣。

（3）若流相中含有緩沖鹽溶液、有機/無機酸或其它電解質，則第 1 步完成后用 95%的去離子水沖洗流路約 20 分鐘后，再按照分析樣品的需要調節比例閥的比例后沖洗流路約 20 分鐘后，待基線走平后即可進樣。

5、洗針

做樣之前，按自動進樣器面板上的“wash”鍵，洗針并排掉針中殘留的氣泡。若針中氣泡仍未清除，則再次按“wash”鍵直至的的氣泡清除為止。

6、進樣

（1）程序文件的建立

泵的流速、各通道的比例；自動進樣器的進樣體積；柱溫箱的溫度；檢測器的波長、測每個樣品需要的時間等等，都得在程序文件里指定。

（2）方法文件的建立

進樣后，軟件會自動采集到色譜圖，需要一個方法文件對這些譜圖進行處理。如積分、定性、定量等等。

（3）樣品序列的建立

標樣有多少個、樣品有多少個，分別要進多少體積等等，都得在序列文件里指定。

（4）進樣

（5）數據處理與報告打印

1、泵

（1） 放置了一天或以上的水相或含水相的流動相如需再用，需用微孔濾膜重新過濾。

（2）流動相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亞甲基氯、四氫呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、異丙醚、酮、甲基環己胺等，以免造成對柱塞密封圈的腐蝕。

2、柱溫箱

柱溫箱一旦發生報警，一定要及時找到原因。若實驗室濕度太高，則需采取相應的除濕措實。若柱溫箱中發生漏液現象，則需及時擰緊色譜柱并擦干漏液，長時間的漏液極易損壞柱溫箱中的傳感器。

3、檢測器

（1） 檢測器的紫外或可見燈在長期打開的情況下，一定要保證有溶液流經檢測池。若不需要做樣，可設置一個較低的流速（如 0.05mL/min）或關閉燈的電源。

（2）檢測器的燈一般是在流通池有溶液連續流動幾分鐘后才開的。如果流動池中有氣泡，則會提示漂移過大無法通過自檢和校正。

（3）檢測器的氘燈或鎢燈不要經常開關，每開關一次燈的壽命約損失 30 小時。若儀器經常使用，可幾天開關燈一次。

4、整個系統

（1） 緩沖溶液的濃度不能高于 0.5 mol/L，pH 范圍 2～12，Cl-的濃度要小于 0.1 mol/L（防

止腐蝕流路）。

（2）儀器長時間不用，每個泵通道和整個流路一定要用甲醇沖洗后保存，以免結晶或造成污染。（3）待測樣品或標樣在流動相中一定要易溶，否則進樣后會結晶造成定量不準確或堵塞色譜柱。

5、軟件

采集紫外信號時，若分析物質的最大波長已知，則盡量減少采集的通道個數，以免占用電腦的空間，特別是 PDA-100 檢測器。