高效液相色譜實驗技術問題解答

1.高效液相色譜是如何實現高效、快速、靈敏的?

解:氣相色譜理論和技術上的成就為液相色譜的發展創造條件，從它的高效、高速和高靈敏渡得到啟發，采用四微粒出定相以提高柱效，采用高壓泵加快液體流動相的流速；設計高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測器，提高檢測靈敏度，克服經典液相色譜曲缺點，從而達到高效、快速、靈敏。
2.與氣相色譜法相比高效液相色譜有哪些優點和不足
解:氣相色譜的分析對象是在校溫下具有一定的揮發性、對熱穩定購物質。因此它只限于分析氣體和沸點低的化合物或揮發性的衍生物。而高效液相色譜由于以液體作為流動相，只要被分析的物質在選用的流動相中有一定的按解度，便可以分析，所以適用性廣，不受樣品揮發性和熱穩定性的限制，特別適合于那些沸點高、極性強、熱穩定性差的化合物，例如，生化物質和藥物、離子型化合物、熱穩定性差的天然產物等。在目前已知的有機化臺物中，只有20％樣品可不經化學處理而能滿意地用氣相色譜分離，80％的有機化合物要用高效液相色譜分析。
氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性，另外可作流動相的化合物多，選擇余地廣。
與氣相色譜相比，高效液相色譜的另一個優點是樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集?；厥帐嵌康?，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質。
高效液相色譜不足的是，日前檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應”對柱效率及色譜分離的影響。
3.試比較氣相色譜與液相色譜的曲線，分析產生不同的原因。
從圖可看出，氣相色譜和液相色譜得到的H-u曲線，形狀迥然不同，流動相的流速對柱效的影響也不一樣，在氣相色譜的H-u曲線上，塔板高度H隨u變化呈雙曲線．曲線有一最低點，這時柱效最高，板高最小，流速最佳。而液相色譜H-u曲線，未出現流速降低板高增加的現象，由于最佳流速趨近于零，一般觀察不到最低板高相對應的最佳流速。在正常的情況下，流速降低，板高H總是降低的，這與氣相色譜明顯不同。在氣相色譜中流動相流速增大，柱效呈直線降低，而在液相色譜中，流動相流速增大，柱效平緩降低。其主要原因是液相色譜的流動相為液體，液相的擴散系數Dm很小，通常僅為氣相擴散系數的10000~100000分之一，所以分子擴散項在低u時也不起多大作用、因此液相色譜H-u曲線未能出現流速降低，板高增加現象。到高速時，雖然柱內線速提高，但固定相和流動相的傳質都能很快進行，故H-u曲線上升緩慢。
4.簡述液相色譜中引起色譜峰擴展的主要因素，如何減少諳帶擴張、提高柱效?
解:液相色譜中引起色諾峰擴展的主要因素為渦流擴散、流動相傳質、停留流動相傳質及柱外效應。在液相色譜中要減小譜帶擴張，提高柱效，要減少續料顆粒直徑，減小境料孔穴深度，提高裝填的均勻性，采用低粘度溶劑作流動相，流速盡可能低，同時要盡可能采用死體積較小的進樣器、檢測器、接頭和傳輸管線等。
5.為什么要提出折合參數有何特點？
解：我們知道色譜操作條件對板高是有影響的．Giddings發現，固定相相同，填充良好，共是粒度dp不同，因而H-u曲線不同，在液相色譜中，培板高度是粒度的函數，為了比較不向色譜條件下的板高H．提出折合參數，包括折合板高、折合流速、折合柱長。其特點是對于不同粒度的填料能得到相同的H-ur 曲線，因此可以在相同的條件下比較不同填料的柱效。
6.色譜柱A長度為15cm，載體粒度為5m．另一B柱長為30cm，載體粒度為10m，兩柱的柱效相等嗎?
解:A柱的折合柱長為30000，B柱的折合柱長也為30000，表明組分在兩根柱內從柱人口到出口都經過30000個載體顆粒．兩校的柱效相等。
7.何謂梯度淋洗，適用于哪些樣品的分析?與程序升溫有什么不同?
解:梯度淋洗就是在分離過程中．讓流動相的組成、極性、pH值等按‘定程序連續變化。使樣品中各組分能在最佳的k下出峰。使保留時間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，保留時間過長而峰形扁平的組分獲得很好的分離，特別適合樣品中組分的k值范圍很寬的復雜樣品的分析。梯度淋洗十分類似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過程序改變柱溫。而液相色譜是通過改變流動相組成、極性、pH值來達到改變k的目的。
8.流動相為什么要預先脫氣?常用的脫氣方法有哪幾種?
解:流動相中溶解氣體存在以下幾個方面的害處，氣泡進入檢測器，引起光吸收成電信號的變化，基線突然跳動，干擾檢測；溶解在溶劑中的氣體進入色譜柱時，可能與流動相或固定相發生化學反應；溶解氣體還會引起某些樣品的氧化降解．對分離和分析結果帶來誤差。因此，使用前必須進行脫氣處理。常用的脫氣法有以下幾種：(1)加熱脫氣法；(2)抽吸脫氣法；(3)吹氦脫氣法；(4)超聲波振蕩脫氣法。
9.按固定相孔徑大小分類，液相色譜固定相有哪幾類?各有什么特性及適用范圍?
解:從固定相的孔隙深度考慮，液相色譜固定相分為表面多孔型(薄殼型)和全多孔型(全孔型)兩類。
表面多孔型固定相多孔層厚度?。诇\，相對死體積小，出峰迅速，柱效高，顆粒較大，滲透性好，由于孔淺，梯度淋洗時，當流動相成分改變后．孔內外流動相成分能迅速達到平衡，機械強度高，裝柱容易，其不足的是由于多孔層厚度小，因而柱容量小，最大允許樣品量受到限制，適用于比較簡單的樣品分析及快速分析。
全多孔型固定相，由于顆粒很細，孔仍然很淺．傳質速度較快，柱效高。梯度淋洗時孔內外流動相成分的平衡速度仍然較快．其最大特點是柱容量大，最大允許樣品量是表面多孔型的5倍，但裝填的什于滲透性低，因而需要更高的操作壓力．制柱比表面多孔型的難。這種固定相特別有利于痕量組分及多組分復雜混合物的分離分析。