高效液相色譜法簡介

以高壓液體為流動相的液相色譜分析法稱高效液相色譜法（HPLC）。其基本方法是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經進樣閥注入的樣品被流動相帶入色譜柱內進行分離后依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色信號或進行數據處理而得到分析結果。

　　由于高效液相色譜法具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、適用范圍廣（樣品不需氣化，只需制成溶液即可）、色譜柱可反復使用的特點，在《中國藥典》中有50種中成藥的定量分析采用該法，已成為中藥制劑含量測定最常用的分析方法。

　　高效液相色譜法按固定相不同可分為液-液色譜法和液-固色譜法；按色譜原理不同可分為分配色譜法（液-液色譜）和吸附色譜法（液-固色譜）等。
　　目前，化學鍵合相色譜應用最為廣泛，它是在液－液色譜法的基礎上發展起來的。將固定液的官能團鍵合在載體上，形成的固定相稱為化學鍵合相，不易流失是其特點，一般認為有分配與吸附兩種功能，常以分配作用為主。C18（ODS）為最常使用的化學鍵合相。
　　根據固定相與流動相極性的不同，液-液色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法，當流動相的極性小于固定相的極性時稱正相色譜法，主要用于極性物質的分離分析；當流動相的極性大于固定相的極性時稱反相色譜法，主要用于非極性物質或中等極性物質的分離分析。

　　在中藥制劑分析中，大多采用反相鍵合相色譜法。

　　系統組成：

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　　由貯液罐、脫氣裝置、高壓輸液泵、過濾器、梯度洗脫裝置等組成。
　　1.貯液罐
　　由玻璃、不銹鋼或氟塑料等耐腐蝕材料制成。貯液罐的放置位置要高于泵體，以保持輸液靜壓差，使用過程應密閉，以防止因蒸發引起流動相組成改變，還可防止氣體進入。

　　2.流動相
　　流動相常用甲醇-水或乙腈－水為底劑的溶劑系統。
流動相在使用前必須脫氣，否則很易在系統的低壓部分逸出氣泡，氣泡的出現不僅影響柱分離效率，還會影響檢測器的靈敏度甚至不能正常工作。脫氣的方法有加熱回流法、抽真空脫氣法、超聲脫氣法和在線真空脫氣法等。

　　3.高壓輸液泵
　　是高效液相色譜儀的關鍵部件之一，用以完成流動相的輸送任務。對泵的要求是：耐腐蝕、耐高壓、無脈沖、輸出流量范圍寬、流速恒定，且泵體易于清洗和維修。高壓輸液泵可分為恒壓泵和恒流泵兩類，常使用恒流泵（其壓力隨系統阻力改變而流量不變）。

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　　常用六通閥進樣器進樣，進樣量由定量環確定。操作時先將進樣器手柄置于采樣位置（LOAD），此時進樣口只與定量環接通，處于常壓狀態，用微量注射器（體積應大于定量環體積）注入樣品溶液，樣品停留在定量環中。然后轉動手柄至進樣位置（INJECT），使定量環接入輸液管路，樣品由高壓流動相帶入色譜柱中。

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　　由柱管和填充劑組成。柱管多用不銹鋼制成。柱內填充劑有硅膠和化學鍵合固定相。在化學鍵合固定相中有十八烷基硅烷鍵合硅膠（又稱ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷鍵合硅膠（C8柱）、氨基或氰基鍵合硅膠等，在中藥制劑的定量分析中，主要使用ODS柱。由于ODS屬于非極性固定相，在分離分析時一般使用極性流動相，所以屬反相色譜法。常用流動相有甲醇－水或乙腈－水等，洗脫時極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱。

　?。ㄋ模z測器
　　在高效液相色譜法中主要使用紫外檢測器（UVD），可分為固定波長、可變波長和二極管陣列檢測器三種類型，以可變波長紫外檢測器應用最廣泛。檢測器由光源、流通池和記錄器組成，其工作原理是進入檢測器的組分對特定波長的紫外光能產生選擇性吸收，其吸收度與濃度的關系符合光吸收定律。